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Le Bacillus thuringiensis israelensis et le contrôle des insectes piqueurs au Québec

3. L'agent de contrôle : le Bacillus thuringiensis var. israelensis

3.1 Historique
3.2 Biologie
3.3 Origine de l'effet larvicide du Bti
3.4 Innocuité du Bti
3.5 Innocuité du Bti pour les humains et les animaux domestiques
3.6 Formulations commerciales du Bti

Figure 2 : Schéma représentant les différents groupes de crustacés et d'insectes présents dans les habitats aquatiques
Figure 3 : Cycle vital du Bacillus thuringiensis var. israelensis
Figure 4 : Photographies de Bacillus thuringiensis var. israelensis prises au microscope photonique et électronique
Figure 5 : Représentation schématique du mode d'action des cristaux de Bacillus thuringiensis var. israelensis sur une larve de moustique

3. L'agent de contrôle : le Bacillus thuringiensis var. israelensis

Autorisés au Canada depuis 1982, les produits larvicides commerciaux à base de Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) sont de plus en plus utilisés pour le contrôle des populations de moustiques et de mouches noires. La grande sélectivité démontrée par cet insecticide est imputable, en bonne partie, aux propriétés de son agent actif : les cristaux de protéines fabriqués par une bactérie indigène de l'environnement terrestre, le Bti.

Dans les paragraphes qui suivent, le potentiel larvicide du Bti est expliqué en présentant quelques faits concernant sa découverte, sa biologie et son habitat naturel. On y souligne aussi l'origine de l'effet toxique, les conditions nécessaires à sa manifestation et conséquemment l'innocuité du Bti pour les insectes (faune cible et non cible) et les mammifères incluant les humains Enfin, la production et la formulation des produits commerciaux à base de Bti sont présentées.

3.1 Historique

C'est en Israël qu'à l'été de 1976 une bactérie démontrant des propriétés hautement larvicides pour les moustiques fut découverte dans une petite mare du désert du Néguev, au cours d'un inventaire des parasites et des pathogènes naturels de ces insectes (Goldberg et Margalit 1977). Malgré le nombre extrêmement élevé de larves mortes et moribondes de Culex pipiens flottant à la surface (elles y formaient un tapis gris-blanchâtre), on a retrouvé vivant de façon normale dans cette mare, de petits crustacés tels que les cyclopoïdes et les ostracodes, de même que plusieurs insectes aquatiques comme les chironomides (moucherons), les éphémères (mannes), les libellules, les corixides (punaises ou criquets d'eau) et les hydrophilides (coléoptère aquatique). C'est à partir d'un échantillon contenant des larves mortes, de l'eau et de la boue que cette nouvelle souche de Bacillus thuringiensis fut isolée et, subséquemment, désignée sous le nom de sous-espèce (variété) israelensis, nom reflétant son origine. On y réfère aussi sous l'appellation sérotype H-14. Depuis ce temps, le Bti fut isolé à partir d'échantillons d'eau, d'insectes et de sols provenant de plus de 15 pays différents (Martin et Travers 1989; de Barjac 1990). Siegel et al. (2001) ont même isolé du Bti à partir de l’eau contenue dans de vieux pneus, de creux d’arbres et de marais salés. Ces isolats de Bti étaient considérés comme endogènes (natifs) du milieu, car leurs profils biochimiques étaient différents des profils associés aux souches de Bti retrouvées dans les formulations commerciales.

Il serait trop long de faire la liste référencée des milieux très différents où du Bt et en particulier des souches de Bti ont été isolées. D’après les travaux de Landén et al. (1994) et de Damgaard et al. (1998) le Bti serait naturellement associé au feuillage des plantes herbacées expliquant ainsi sa présence un peu partout dans l’environnement. Ces auteurs (et d’autres également) ont même isolé des souches ayant de fortes activités contre des larves de moustiques, mais n’appartenant pas au sérotype H-14 (Bti).

Bien que le Bti n'ait pas, à ce jour, officiellement été répertorié au Québec, il y a tout lieu de croire que, considérant la littérature scientifique, le Bti est aussi endogène au Québec.

Figure 2 - Schéma représentant les différents groupes de crustacés et d'insectes présents dans les habitats aquatiques
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Découvert au cours d'un effort mondial ayant pour but de développer de nouveaux agents biologiques de contrôle pour la lutte contre les vecteurs de maladies tropicales (ex. malaria et l'onchocercose), le Bti a démontré un effet larvicide important sur de nombreuses espèces de moustiques et mouches noires testées. En 1985, Margalit et Dean (1985) rapportaient que 72 espèces de moustiques et 14 espèces de mouches noires étaient sensibles à l’action du Bti. Treize ans plus tard, ce nombre s’établissait à plus de 115 espèces de moustiques et 40 espèces de mouches noires (Glare et O'Gallaghan, 1998). Entretemps, de nombreux programmes de contrôle des insectes piqueurs se développaient un peu partout dans le monde (France, Allemagne, Australie, États-Unis, etc.) agrandissant ainsi le spectre d’activité du Bti. Non seulement cette découverte signala un tournant marquant pour le contrôle de ces insectes, mais elle fut la première observation d'une souche de Bacillus thuringiensis exhibant un effet toxique élevé et hautement spécifique contre certains diptères aquatiques — plus précisément certains membres du sous-ordre des nématocères (Figure 2).

Avant cette découverte, seulement quelques souches de Bacillus thuringiensis démontraient une faible activité larvicide chez les moustiques. De plus, le champ de bataille du Bt était principalement restreint à l'agriculture et à la foresterie, avec des sous-espèces tuant surtout les larves d'insectes se nourrissant sur les récoltes ou les arbres (ex. le Bt var. kurstaki pathogène pour la tordeuse du bourgeon de l’épinette). Avec la venue du Bti, la portée des bactéries entomopathogènes fut grandement étendue et cette expansion se poursuit de nos jours avec l'isolation de nouveaux candidats comme le Bt var. morrisoni qui démontre en laboratoire un potentiel larvicide aussi bon que celui du Bt var. israelensis. Récemment, Margalith et Ben-Dov (2000) rapportaient que quatre autres sérotypes de Bt exhibaient également des pouvoirs larvicides importants, ce qui laisse entrevoir pour l’avenir, une meilleure gestion des programmes de contrôle. Présentement, seuls le Bacillus thuringiensis var. israelensis et le Bacillus sphaericus (pesticides d’origine biologique) sont homologués en Amérique du Nord pour le contrôle des moustiques et des mouches noires (exception faite d’un produit à base d’un champignon).

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3.2 Biologie

Membres de la grande famille des Bacillusi.e. des bactéries ayant la forme d'un bâtonnet et dont la grande majorité des membres sont des saprophages (organismes vivant de matières organiques en décomposition) que l'on retrouve couramment dans le sol et dans l'air —, les Bacillus thuringiensis tout comme les Bacillus popilliae, Bacillus alvei, Bacillus larvae, Bacillus lentimorbus et le Bacillus sphaericus possèdent la propriété particulière d'induire une mortalité chez certains insectes. Le pathogène humain le plus connu dans cette famille s'appelle le Bacillus anthracis. Le Bacillus cereus souvent cité comme étant responsable de certaines intoxications alimentaires ne possède aucune propriété infectieuse, c'est-à-dire capable de causer une infection primaire chez un hôte (Gilbert 1979, Johnson 1984).

Le groupe des B. thuringiensis représente une espèce qui possède des similarités morphologiques et génétiques bien connues avec les B. cereus (Baumann et al. 1984). D'ailleurs, selon des chercheurs de l'Institut Pasteur à Paris (de Barjac et Frachon 1990), B. thuringiensis serait un B. cereus capable de synthétiser une structure cristalline pouvant tuer des larves de divers insectes de l'ordre des lépidoptères, des diptères et des coléoptères. À ce jour, aucune souche de Bt n'a été directement associée à une intoxication alimentaire ou impliquée de manière concluante dans un incident de santé, que ce soit chez les humains ou tout autre mammifère (Meadows 1993).

Figure 3 - Cycle vital du Bacillus thuringiensis var. israelensis

Figure 4 - Photographies de Bacillus thuringiensis var. israelensis prises au microscope photonique et électronique

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La caractéristique la plus distinctive des Bacillus thuringiensis est cette inclusion cristalline (le corps paracristallin, ou plus courant, le cristal) constituée de protéines insecticides, produite en même temps que la spore à l'intérieur de la bactérie durant son cycle vital (figures 3 et 4). Lorsque cette spore — corpuscule équivalent à la graine d'une plante permettant la survie de la bactérie lors de conditions défavorables — se retrouve dans un milieu de croissance approprié, elle se réhydrate (phase no 1; figure 3b) et germe pour donner naissance à une cellule végétative en forme de bâtonnet (phase no 2; figure 3b) qui constitue la phase active ou de multiplication du cycle vital. Au cours de cette période de division et de croissance (phase no 3; figure 3b), les bactéries sécrètent des enzymes qui dégradent des sources nutritives (phase no 3a; figure 3b) — comme les débris cellulaires provenant de plantes ou d'animaux — favorisant ainsi leur absorption à partir du milieu. Après cette phase, les bactéries peuvent se mettre à sporuler. Certaines produiront alors une cellule déshydratée et encapsulée contenant une copie du matériel génétique de la bactérie, la spore, qui ne croît plus (figure 1a, spore : s; figure 3b, phase no 4, spore : s; figure 4) et qui sera capable de résister aux diverses conditions extrêmes du milieu. Au cours de cette phase, une inclusion cristalline composée de plusieurs protéines de différents poids moléculaires est conjointement formée (figure 3a, cristal : c; figure 3b, phase no 4, cristal : c; figure 4), et vers la fin de chaque cycle (germination—développement—sporulation), la spore et le cristal (de type polymorphe, figure 4a : encadré) sont libérés dans le milieu lors de la lyse (l’autodestruction) de la cellule végétative (phase no 5; figure 3b). Après une période de dormance, période où il ne se produit aucune activité cellulaire, une partie de ces spores peuvent alors redémarrer le cycle si les conditions environnementales sont favorables. La différence dans le niveau de toxicité (quantité nécessaire pour induire un effet toxique) et la spécificité (nombre d'espèces d'insectes affectés) des types de cristaux produits par les différentes sous-espèces de Bt sont reliées aux types de protéines assemblées dans cette inclusion cristalline (figure 4) (Honée et Visser 1993, Lereclus et al. 1993, Margalith et Ben-Dov 2000).

Diverses études indiquent qu'en nature le Bt persiste dans le sol surtout sous forme de spores et ne démontre que très peu de multiplication des cellules végétatives (West et al. 1985, Akiba 1986). Il apparaît donc invraisemblable que le Bt utilise de l'énergie et des éléments nutritifs durant la sporulation — qui se produit généralement en période de manque de nourriture ou de stress physiologique — pour produire une structure de protéines occupant près de 35 % du poids sec de la bactérie (Meadows 1993), sans que cela lui confère un avantage évolutif. Il est bien connu que les cellules végétatives ne peuvent se développer dans un environnement à pH élevé (condition prévalant dans le tractus digestif de certains insectes; pH > 10), mais que cet environnement alcalin est cependant indispensable à l'activation des toxines. Chez les organismes affectés, la paralysie, les changements biochimiques (comme la baisse du pH vers la neutralité; i.e. pH = 7) et la perforation de la paroi intestinale, tous induits par l'effet toxique (le principe actif des cristaux de Bt est expliqué en détail dans la section suivante), permettent donc à la spore de se retrouver dans un milieu riche en éléments nutritifs où la germination, la croissance et la multiplication peuvent prendre place. Sans cette structure cristalline, le Bt serait donc incapable de coloniser le tractus digestif d'un insecte en santé et de se reproduire aisément (Meadows 1993).

Plusieurs études démontrent que le Bt est une bactérie indigène de multiples environnements. L'analyse d'échantillons de sols de 30 pays représentant cinq continents a révélé la présence de plusieurs sous-espèces de Bt dans plus de 70 % des cas. Ce pourcentage varie d'un maximum de 94 % en Asie, en Afrique centrale et en Afrique du Sud, à un minimum de 56 % en Nouvelle-Zélande. Plus de 60 % des échantillons de sol provenant de l'Amérique du Nord contenaient pour leur part cette souche de bactérie. Le Bt peut aussi être facilement isolé des insectes, de la poussière de grains, des feuilles d'arbres et de divers habitats aquatiques ; cependant, il ne semble y avoir aucune corrélation entre la présence du Bt dans le sol et celle d'insectes (Meadows 1993).

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3.3 Origine de l'effet larvicide du Bti

Contrairement à d'autres sous-espèces de Bt qui nécessitent la présence de cristaux et de spores pour induire la mort chez un insecte (ex. le Bt kurstaki contrôlant la tordeuse du bourgeon de l’épinette ; le Bt aizawai utilisé chez la fausse-teigne de la cire infestant les ruches d'abeilles), l'effet insecticide du Bt israelensis provient exclusivement du cristal, agissant comme le ferait un poison. Les spores et les cellules végétatives du Bti ne sont aucunement impliquées dans le processus insecticide (Becker et Margalit 1993).

Lorsqu’elles sont ingérées par une larve, les inclusions cristallines sont partiellement dissoutes dans le liquide alcalin du tractus digestif, libérant ainsi de longues chaînes de protéines qui sont les différents précurseurs des toxines ; elles ont donc été nommées les protoxines ou ∂-endotoxines (delta-endotoxines) (figure 5, étapes 1 et 2). Ces longues chaînes de protéines sont par la suite sectionnées par des enzymes (les protéases) pour produire de petites molécules de grosseurs prédéterminées; les segments toxiques, dénommés les « toxines ». Le cristal du Bti contient au moins quatre de ces segments toxiques, chacun possédant sa propre activité (figure 5, étape 3) (Ibarra et Federici 1986, Ward et al. 1986, Becker et Margalit 1993, Margalith et Ben-Dov 2000). Bien que le mode d'action précis de chacune de ces molécules ne soit pas pleinement élucidé, il est maintenant connu que l'intoxication est le résultat combiné de l'action de chacune d'elles (Delécluse et al. 1988, Federici et al. 1990, Honée et Visser 1993, Margalith et Ben-Dov 2000). Ces derniers auteurs ont fait une excellente revue sur le sujet, i.e. les protéines constituantes et leurs modes d’action.

Le cristal de Bacillus thuringiensis var. israelensis est un « poison stomacal ». D'après plusieurs études physiologiques et immunologiques, les cellules de la paroi de la portion médiane du tractus digestif sont le site initial de l'action toxique (de Barjac 1978, Hofmann et Lüthy 1986). Après la libération des segments toxiques par le liquide alcalin et les enzymes intestinales, ces molécules se fixent sur des récepteurs spécifiques situés sur la membrane des cellules formant le tube digestif (figure 5, étape 4), immobilisant ainsi les toxines sur la membrane de ces cellules (Honée et Visser 1993). Par la suite, provoquées par le déséquilibre biochimique induit par l'activité des toxines, les cellules affectées se gonflent et éclatent (figure 5, étapes 5, 6 et 7), causant la perforation de la paroi du tube digestif (Charles et de Barjac 1983). Ceci provoque le passage du suc digestif dans la cavité corporelle de l'insecte et le mouvement inverse de l'hémolymphe (l'équivalent du sang chez les insectes) (figure 5, étape 7). Bien que certains effets neurotoxiques aient été aussi observés (Cheung et al. 1986), il semble qu'une perte complète d'intégrité causée par l'éclatement de son tube digestif serait la cause de la mort chez un insecte empoisonné aux cristaux de Bacillus thuringiensis var. israelensis (Lüthy et Ebersold 1981, Chilcott et al. 1990).

Plusieurs étapes sont donc nécessaires à l'obtention d'un effet toxique occasionné par des cristaux de Bacillus thuringiensis var. israelensis. Sous des conditions naturelles, c'est-à-dire dans son habitat, un insecte doit, pour mourir :

  1. ingérer le cristal de Bti, donc le capturer et l'avaler;

  2. posséder un tube digestif à pH hautement alcalin;

  3. posséder les enzymes protéolytiques capables de transformer les protoxines en molécules toxiques et finalement,

  4. posséder les récepteurs membranaires adéquats, c'est-à-dire compatibles avec les toxines libérées par les enzymes.

Figure 5 - Représentation schématique du mode d'action des cristaux de Bacillus thuringiensis var. israelensis sur une larve de moustique
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La présence ou l'absence de récepteurs cellulaires appropriés semble être un des facteurs-clefs de la haute spécificité des cristaux de Bt (i.e. effet limité à un petit nombre d'espèces sensibles). Étant donné que le type de protéines assemblées dans l'inclusion cristalline peut varier entre sous-espèces de Bt, l'intensité de l'effet toxique observée serait donc le résultat de la grande affinité ou du grand nombre de récepteurs présents chez une espèce d'insecte donnée (Honée et Visser 1993). Ceci explique sans doute la différence de susceptibilité d'un insecte aux cristaux des différentes sous-espèces de Bt. Par exemple, les cristaux de Bt var. kurstaki sont très actifs contre les lépidoptères, mais ne démontrent qu'une faible activité contre les moustiques et aucune activité contre les mouches noires, tandis que les cristaux de Bt var. israelensis sont très actifs contre les moustiques et les mouches noires, mais n'ont qu'une faible, voire aucune activité contre les larves de lépidoptères (Federici et al. 1990).

Les insectes les plus susceptibles aux cristaux de Bti sont pour la très grande majorité membres de la même « famille », c'est-à-dire qu'ils proviennent tous d'un même ancêtre lointain qui vécut voici des millions d'années. Le spectre d'activité du Bti est principalement restreint aux membres des nématocères (sous-ordre), un sous-groupe de l'ordre des diptères. Cependant, les plus hauts taux de susceptibilité ne se retrouvent que parmi certains membres d'un sous-groupe, les culicomorpha (infra-ordre) regroupant, entre autres, les familles des culicidae (les moustiques), des simuliidae (les mouches noires) et une grande partie des moucherons (chironomidae, ceratopogonidae et autres); les moustiques et les mouches noires étant les plus susceptibles (Figure 2). Probablement en raison de certaines variations génétiques et comportementales au sein de ces deux familles, il existe des différences de sensibilité entre les espèces formant chacune de ces familles, de même que parmi les différents stades larvaires d'une même espèce. Par exemple, les Aedes et Ochlerotatus sont plus sensibles que les Culex et les deuxièmes stades larvaires (plus jeunes) sont plus sensibles que les troisièmes. Un fait intéressant, les larves qui se préparent à la métamorphose (autant chez les moustiques que les mouches noires) cessent de se nourrir et par conséquent sont totalement insensibles au Bti.

L'activité larvicide du Bacillus thuringiensis var. israelensis provient de la structure cristalline. Le spectre d'activité étroit démontré par les cristaux de Bti — c'est-à-dire une spécificité pour un nombre restreint d'espèce d'insectes — tient donc de facteurs comportementaux (reliés à l'ingestion obligatoire des protoxines; les cristaux), physiologiques (alcalinité et enzymes) et finalement génétiques (récepteurs cellulaires compatibles aux toxines). Les recherches sur le mode d'action et les causes physiologiques de la sélectivité des cristaux de Bti se poursuivent.

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3.4 Innocuité du Bti

Les formulations à base de Bacillus thuringiensis sont les plus répandues (et les plus vendues) parmi les insecticides biologiques. Comme pour beaucoup de personnes, le mot bactérie est associé à maladie et il n’est pas surprenant de retrouver dans la littérature un bon nombre d'articles scientifiques rapportant les résultats de travaux sur son innocuité, i.e. « le Bti est-il sans danger pour un organisme donné, incluant les humains? » Cependant, puisque les tests sont le plus souvent conduits en utilisant des préparations pures ou mixtes de cristaux entiers ou dissous, de spores, de débris cellulaires, de produits de fermentation et autres, l'interprétation des résultats devient très complexe lorsque faite en fonction de l'utilisation normale de ces produits sur le terrain. De plus, peu de travaux concernant l'innocuité de formulations commerciales intégrales sont publiés; ceci tient probablement au fait que des résultats démontrant l'absence d'effet toxique ne soient que rarement publiés dans les ouvrages scientifiques.

Pour s'assurer qu'un produit est sécuritaire, son innocuité — à savoir s'il est inoffensif pour un organisme donné — doit être évaluée. Les tests d'innocuité regroupent notamment des essais représentant des conditions opérationnelles — i.e. en situations se retrouvant lors de l'usage d'un produit — et des situations extrêmes — i.e. en utilisant des doses et des voies d'infection qui ne sont pas normalement rencontrées sous des conditions normales. Selon des normes établies par les agences de réglementation régissant l’homologation des divers insecticides biologiques, les produits sont testés par ingestion (test per os), inhalation (nez et trachée), application et injection. Les applications peuvent être cutanées (égratignures sur la peau) et oculaires (égratignures sur la cornée, ou déposition sur l'œil), tandis que les injections sont soit sous-cutanées (sous la peau), intra-veineuses (dans le sang), intra-oculaires (dans l’œil), intrapéritoniales (dans l'abdomen) ou intracérébrales (dans le cerveau). Les animaux testés sont le plus souvent des lépidoptères (ex. vers à soie), des mouches domestiques, des abeilles et des coquerelles chez les invertébrés (larves, nymphes et adultes), et les souris, les rats, les lapins et les cailles chez les vertébrés (nouveau-nés, nourrisseaux et adultes). Dans certains cas, des souris génétiquement immunodéficientes — des souris athymiques, i.e. ne possédant pas de système immunitaire complet ou un système défectif — sont aussi utilisées. Quelques tests sont parfois effectués sur des cultures de tissus (ou culture cellulaire) — des cellules de vertébrés (ex. cellules de foie de souris ou d'humain) ou d'invertébrés (ex. cellules de papillons ou de moustiques) cultivées et maintenues en laboratoire. Plusieurs de ces tests d'innocuité sont de type « Impact maximal » (Maximum Challenge) ou « Danger maximal » (Maximum Hazard), i.e. que les tests sont faits pour déterminer si des conditions extrêmes à propos des doses appliquées occasionnent des dommages détectables chez les sujets traités. Pour ces tests, les voies d'application et les doses sont sélectionnées pour compromettre le plus possible le système de défense naturelle du sujet testé.

L'innocuité des inclusions cristallines du Bacillus thuringiensis var. israelensis varie considérablement selon la méthode d'administration et leur mode d’emploi, intactes ou dissoutes. Cependant, puisque les inclusions cristallines requièrent une solubilisation alcaline pour démontrer une activité toxique, les premières préoccupations touchant la sécurité d'utilisation du Bti concernent la vérification du potentiel infectieux de cette bactérie et de la toxicité aiguë de ses cristaux non solubilisés (Siegel et al. 1987).

Dans un rapport de l'Organisation mondiale de la santé sur l'innocuité du Bti sur les mammifères, Shadduck (1980) conclut, après avoir exposé des souris, des rats et des lapins à des préparations de Bti provenant de trois souches standard (bactéries servant pour les formulations commerciales) par voies orales, oculaires, intrapéritoniales et intracérébrales, que : 1) l'injection de Bti n'a aucun effet négatif à moins que plus de 1 million (106) de cellules viables ne soient introduites directement dans le cerveau; 2) aucune multiplication du Bti ne se produit chez les mammifères — les bactéries peuvent persister au site de l'injection pour deux à trois semaines et se logent dans la rate où elles peuvent être détruites; 3) sous forme de poudre, le Bti appliqué sur un œil n'est que légèrement irritant et ne peut y persister plus de un mois suivant la période d'application. Les mêmes conclusions furent obtenues suivant l'évaluation de l'innocuité de six préparations commerciales de Bti (Siegel et al. 1987). Siegel et ses collèges notent que, chez le rat, toutes les préparations sont toxiques lorsqu’elles sont injectées dans le cerveau à des concentrations excédant 10 millions (107) de bactéries. Ils précisent cependant qu'une injection par voie intracérébrale représente un cas extrême d'exposition au Bti, et que, de plus, des bactéries prouvées non pathogènes injectées de cette façon peuvent aussi causer la mort. Les mêmes auteurs signalent que le Bti a disparu du cerveau en l'espace de 27 jours et que les poumons étaient stériles en moins de trois jours suivant son inhalation, stipulant que, bien que les vitesses d'élimination des bactéries aient été différentes entre les souris normales et les souris immunodéficientes, un système immunitaire intact n'était pas essentiel à la prévention d'une infection par le Bti.

Séparés des bactéries, des spores et des débris du milieu de croissance, les cristaux purifiés de Bti n'ont causé aucun effet toxique lorsqu'ils avaient été administrés par voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse chez la souris, ou appliqués sur des cultures de tissus (moustiques, lépidoptères, souris et porc), ou sur des érythrocytes — globules rouges — de cheval, de mouton et d'humain (Thomas et Ellar 1983). Cependant, les mêmes auteurs démontrent que solubilisés par incubation dans une solution à pH > 10,5 (simulant ainsi la condition alcaline extrême du tractus digestif des insectes), ces mêmes cristaux peuvent être toxiques lorsqu'ils sont administrés par voie sous-cutanée et intraveineuse chez la souris, et produisent un effet cytolytique (destruction de cellules) et hémolytique (destruction des globules rouges) sur les différentes cultures et préparations testées (Thomas et Ellar 1983). Dans une étude sur l'effet toxique des cristaux solubilisés de Bti, Roe et ses collègues (1991) rapportent que l'injection de cristaux solubilisés dans l'hémolymphe a causé la mort d'une variété d’insecte (ex. moustiques, mouches domestiques, coquerelles et papillons), et que l'injection intrapéritoniale est la seule voie qui a provoqué la mort chez le rat (dose : 9 mg cristaux dissous/kg de poids animal), la souris (1,4 mg/kg) et la caille japonaise (30 mg/kg) (Roe et al. 1991; Kallapur et al. 1992). Les injections par voies orales (plus de 30 mg/kg chez la souris), sous-cutanées (9 mg/kg chez le rat), intraveineuses (21 mg/kg chez le rat), intratrachéales et intranasales n'ont causé aucune mortalité sur les mêmes animaux (Roe et al. 1991).

Qu'ils soient ingérés intacts ou solubilisés, les cristaux de Bacillus thuringiensis var. israelensis ne sont toxiques que pour certains insectes. Exposé de façons conventionnelles (orale, oculaire, inhalation, sous-cutanée), le Bti ne démontre aucun caractère virulent ou envahissant chez les mammifères. Sous des conditions opérationnelles, les dangers encourus par une personne exposée à des formulations commerciales de Bti se résument principalement à l'absorption accidentelle d'un produit contenant possiblement des spores (certaines formulations) et des cristaux non dissous (toutes les formulations) par voie d'ingestion, d'inhalation et de contacts oculaires ou sous-cutanés (ex. lésion de la peau). Dans la majorité des travaux rapportant un effet toxique, les voies d'applications et les doses étaient sélectionnées pour compromettre le plus possible le système de défense naturelle du sujet testé, d'où par exemple, l'utilisation de cristaux dissous en milieu alcalin — condition indispensable à l'induction d'un effet toxique. Bien que ces conditions ne représentent pas nécessairement celles que l’on rencontre en « nature », elles nous indiquent la marge de sécurité disponible lors de l'utilisation.

L'ensemble des études sur l'innocuité du Bacillus thuringiensis var. israelensis, et particulièrement celles du Département de pathologie vétérinaire de l'Université de l'Illinois (World Health Organisation Center for Safety of Biological Agents to Mammals), indique que cet entomopathogène peut être utilisé sans risque pour les humains et tout autre mammifère potentiellement exposé (Shadduck 1980, Thomas et Ellar 1983, Lacey et Undeen 1986, Siegel et al. 1987, Siegel et Shadduck 1990a et 1990b, Roe et al. 1991, Kallapur et al. 1992; Siegel 2001). Cependant, il est important de se rappeler que la manipulation de tout produit à base de microorganismes doit toujours se faire dans un minimum de conditions de sécurité.

Pour de l'information concernant le processus d’homologation des insecticides biologiques au Canada, le lecteur peut consulter le site Web de l’Agence de réglementation pour la lutte antiparasitaire (ARLA).

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3.5 Innocuité du Bti pour les humains et les animaux domestiques

Trois rapports dans la littérature scientifique font état de l'implication possible de Bacillus thuringiensis dans des cas d'infections d'humains et d'animaux domestiques. Les deux premières instances relatent l'isolation de Bt de lésions associées à une mastite bovine fatale (Gordon 1977) et d'un ulcère oculaire chez un humain accidentellement éclaboussé par une formulation insecticide commerciale (Samples et Buettner 1983). Le troisième cas implique le Bt var. israelensis dans un accident de laboratoire où un étudiant s'est accidentellement injecté dans la main, une suspension très concentrée de spores de Bti (6 x 108/ml), contaminée par une autre bactérie (Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus) causant d'après les auteurs des effets cliniques sérieux (Warren et al. 1984).

Dans les trois cas, les auteurs n'ont pu établir de façon concluante que le Bti était l'agent causal des problèmes décrits. À l'exception du dernier cas où il est clairement établi que le début des problèmes coïncide exactement avec l'exposition au Bti, dans les deux autres cas, la présence du Bt ne fut démontrée que plus tard après l'apparition des problèmes. D'après Siegel et Shadduck (1990b), le seul fait d'avoir retrouvé du Bt dans une lésion n'est pas une preuve suffisante pour conclure qu'il est l'agent causal de la pathologie, poursuivant qu'à la lumière de leurs expériences d'infection et de persistance, ils ont démontré que le Bti peut persister dans un organisme pendant des semaines sans causer d'infection. Dans une revue de littérature, Siegel (2001) rapportait que dans les études sur l’innocuité des souches de Bacillus thuringiensis, on oubliait de nombreux éléments dont le facteur de comparaison corporelle et que de fait, des auteurs faisaient fausse route dans leurs conclusions. Par exemple, une injection sous-cutanée de 108 spores (cent millions) de Bti dans une souris correspondrait à une injection de 1011 spores (cent mille millions) chez un humain; une situation dont les probabilités de se produire sont pour ainsi dire inexistantes. En 1999, un groupe d’experts mandatés par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en venait à la conclusion que les souches de Bacillus thuringiensis utilisées pour le contrôle des pestes agricoles et forestières ainsi que le Bti étaient très sécuritaires; suffisamment pour que l’on accepte que des formulations de Bti soient mises dans l’eau de consommation afin de détruire les larves de moustiques (WHO, 1999).

Dans un rapport sur l’utilisation de larvicides pour contrer la transmission du virus du Nil (VNO), l’Institut national de santé publique (INSPQ) conclut que l’utilisation des insecticides à base de Bti ne présente pas de risques notables pour la santé publique (Chevalier et al. 2002).

3.6 Formulations commerciales du Bti

Comme bien d'autres bactéries, le Bacillus thuringiensis var. israelensis est cultivé par fermentation dans un milieu scientifiquement développé. Puisque les cristaux sont la source de l'effet larvicide, la composition du milieu de culture et tous les paramètres environnementaux sont ajustés pour assurer leur production optimale, c'est-à-dire favoriser, entre autres, le plus grand nombre de cycles germination—multiplication—sporulation. Il n'est donc pas surprenant, considérant l'énormité des sommes d'argent consacrées au marché des insecticides biologiques, que les méthodes de fermentation et de préparation des différentes formulations demeurent un secret industriel bien gardé. Il est cependant possible, sans connaître le nom et les proportions exactes des produits utilisés dans la production et la formulation d'insecticide à base de Bti, d'identifier les grands groupes d'éléments qui donnent à une formulation, ses caractéristiques.

Suivant une fermentation sous des conditions optimales, le matériel particulaire (cristaux, spores, débris cellulaires et matériel non soluble) est séparé du milieu de culture par filtration ou centrifugation. Séchée ou partiellement déshydratée, la « pâte » ainsi obtenue constitue la « matière active » utilisée dans la confection des diverses formulations. Bien qu'elle puisse être directement utilisée comme insecticide, cette matière est davantage transformée pour être plus adaptée aux exigences des conditions opérationnelles de terrain, afin d'assurer un contrôle efficace des populations d'insectes visés (Bernhard et Utz 1993). À cette fin, les principaux objectifs lors de la formulation d'un produit sont :

  1. l'obtention d'un taux d'activité larvicide prédéfini tel qu’il est décrit sur l'étiquette d'un produit, par l'utilisation de diluant (s) (ex. eau, huile végétale, poudre d'argile);

  2. l'obtention de propriétés physiques facilitant la manipulation, le mélange et l'application d'un produit, par l'addition de produit (s) inerte (s) (ex. émulsifiant, agent antimoussant, sable, concassé de maïs);

  3. le maintien de l'intégrité biologique du produit jusqu'à la date d'expiration indiquée, par l'addition de produit (s) stabilisateur (s) (ex. agent anti-oxydant, agent antibactérien);

  4. l’augmentation, dans certains cas, de la palpabilité et de la persistance du produit, par l'addition de produits adaptés (ex. agent permettant de rendre le matériel plus attrayant pour l'insecte visé, agent permettant de maintenir l'activité du matériel après son application); et

  5. la fabrication d’un produit possédant un bon rapport, rendement-coûts.

Les produits commerciaux à base de Bti se présentent généralement sous quatre grands types : les poudres, les granules, les briquettes et les liquides. Le choix de la formulation à employer dépend de l'insecte visé par le contrôle, du type d'environnement à traiter et de son accessibilité, et de la persistance de l’effet toxique visée par l’applicateur. Voir l’annexe 1 pour la liste des produits homologués au Canada. Au Québec, dans le cas du contrôle des populations larvaires de mouches noires, les formulations liquides sont presque exclusivement utilisées en raison de leurs facilités de manipulation et de leurs propriétés dispersantes en eaux courantes. Ces mêmes formulations liquides sont aussi couramment employées pour le contrôle des larves de moustiques. Toutefois, les formulations granulaires sont de préférence utilisées lorsque la végétation interfère avec l'application aérienne du produit — les granules pénètrent plus aisément le couvert végétal pour se rendre dans l'eau du gîte. Présentement au Canada, seuls les formulations liquides et les granules sont homologués. Il est cependant connu que les briquettes, en raison de leurs formulations permettant le relargage continu du produit actif, sont utilisées dans certaines régions des États -Unis où les traitements doivent être régulièrement répétés sur des gîtes à accès limités. Les poudres de Bti ne sont plus utilisées, puisqu’elles ont été remplacées par des formulations améliorées de type liquide et granulaire.

Il n'existe aucun test chimique ou immunologique permettant d'évaluer facilement la quantité de cristaux présents dans une formulation donnée, d'où l'incapacité d'exprimer, sous forme de poids (ex. mg/l), la quantité de toxine réelle. Le potentiel larvicide d'une formulation est donc évalué directement par un test de toxicité (essai biologique ou bio-essai) sur des larves d'Aedes aegypti, un moustique possédant une répartition quasi mondiale. Un bio-essai est essentiellement une mesure de l'interaction entre un insecte-test et la substance toxique choisie. La réponse la plus dramatique d'un individu à une toxine en est une facilement observable : sa mort. Par ailleurs, l'expression la plus précise du pouvoir mortel est la DL50 (dose létale 50 %), la concentration qui tuera 50 % du groupe d'individus exposés. Cette concentration est déterminée en exposant différents groupes d'individus à des concentrations variables de toxines, en laissant incuber les individus pour un certain temps, en observant la mortalité dans chacun des groupes et en déterminant mathématiquement ou graphiquement la DL50 par régression. La DL50 est un excellent outil, mais la vigueur des insectes -tests et leur réponse à la toxine peuvent varier de jour en jour; ce qui fait conséquemment fluctuer la DL50 et diminuer la précision de l'évaluation. La solution est donc d'effectuer simultanément le même test sur la même population d'insectes en employant une préparation standard, pour ensuite comparer les deux DL50. Connaissant l'activité toxique de la préparation standard, le potentiel d'une formulation est exprimé en fonction d'unité insecticide en utilisant l'équation suivante :

Activité de la Formulation (UIT/mg)

=

DL50 Standard

X Activité du Standard (UIT/mg)

DL50 Formulation

par exemple : après les essais biologiques, la DL50 de la formulation est estimée à 10 mg/l et la DL50 de la préparation standard, à 20 mg/l; sachant qu'il a été décrété que la préparation standard a une activité de 15 000 UIT, l'activité de la formulation sera donc :

Activité de la Formulation (UIT/mg)

= 20 mg/l X 15 000 UIT/mg = 30 000 UIT/mg
10 mg/l

Ce potentiel toxique est généralement exprimé en Unité internationale toxique (UIT) ou en Unité Aedes aegypti (UAA) selon le type de préparation standard utilisée. Initialement, le potentiel toxique d'une formulation était exprimé en nombre de spores par gramme de produit. Cependant, puisque le nombre de cristaux engendrés n’a aucun lien avec celui des spores lors de la production en masse du Bti, et que l'effet insecticide provient exclusivement des cristaux, cette pratique fut délaissée au profit du système des unités internationales. Le potentiel toxique de toute formulation se doit de correspondre à un niveau minimal annoncé par les spécifications du produit (potentiel toxique spécifié par le manufacturier lors de l'homologation du produit par Santé Canada), d'où l'affichage de ces unités sur l'étiquette. Le consommateur est donc assuré de la constance de la formulation. Cependant, il est à noter que ces unités ne sont pas nécessairement une indication de l'efficacité sous conditions de terrain. De plus, le potentiel toxique d'une formulation sur une population de mouches noires ne peut être prédit à partir de l'activité toxique des cristaux de Bti exprimée en UIT, donc évaluée sur les larves de moustiques (Molloy et al. 1984).

     


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